Цитохимическое исследование гликогена

Цитохимическое исследование гликогена

Гликоген локализуется в цитоплазме клеток и играет важную роль в энергетическом метаболизме клеток. При цитохимическом исследовании гликогена используют главным образом PAS-реакцию или ШИК-реакцию (по названию реактивов - шиффйодная кислота).

Метод Шабадаша

Под влиянием перйодата калия гликоген окисляется с образованием альдегидных соединений, легко реагирующих с реактивом Шиффа (фуксин-сернистая кислота). В местах локализации гликогена выявляется вишнево-фиолетовое окрашивание, по интенсивности которого можно судить о количестве гликогена в клетках.

Посуда и оборудование

Химические стаканы емкостью 50 мл или кюветы.

Мерные цилиндры.

Градуированные пипетки.

Колбы емкостью 250 мл.

Воронки.

Горелки.

Термостат.

Весы.

Реактивы

0,03 М раствор перйодата калия или натрия: 230 мг перйодата растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Готовят перед употреблением.

Реактив Шиффа: 1 г основного фуксина растворяют в 200 мл кипящей дистиллированной воды. По мере охлаждения в раствор добавляют 1 г метабисульфита калия и 20 мл 1 н. раствора соляной кислоты. Оставляют на сутки. Для полного обесцвечивания добавляют растолченную таблетку карболена, оставляют на сутки, затем фильтруют. Реактив сохраняют в темноте (лучше на холоде) в плотно закрытой посуде. Годен к употреблению в течение нескольких месяцев (легкая степень покраснения свидетельствует о непригодности реактива).

Сернистая вода: к 10 мл 10% раствора метабисульфита калия добавляют 200 мл дистиллированной воды и 10 мл 1 н. раствора соляной кислоты. Готовят перед употреблением.

Реактив Шабадаша: к 100 мл этилового спирта добавляют 1,8 г нитрата меди, 0,9 г нитрата кальция и 10 мл формалина.

1 н. раствор соляной кислоты (82,5 мл концентрированной соляной кислоты удельного веса 1,19 доливают дистиллированной водой до 1 л).

0,1% спиртовой раствор светло-зеленой краски (лихтгрюн).

Ход окраски

Препараты фиксируют (тотчас после приготовления) в жидкости Шабадаша в течение 30 мин.

Промывают в двух сменах дистиллированной воды.

Погружают в раствор перйодата на 20 мин (в темноте).

Промывают в трех сменах дистиллированной воды.

Ополаскивают в сернистой воде (в течение 1 - 2 мин).

Окрашивают реактивом Шиффа в течение 30 - 40 мин (в темноте).

Промывают в трех сменах сернистой воды по 3 мин.

Промывают в трех сменах дистиллированной воды по 3 мин.

Окрашивают светло-зеленой краской в течение 10-20 с.

Промывают в дистиллированной воде.

Для проведения реакции удобно все растворы поместить в химические стаканчики или кюветы и переносить препараты в указанной выше последовательности.

В настоящее время существуют реагенты для цитохимического исследования на гликоген заводского производства, которые более просты в применении. К сожалению, не все из них обладают хорошим качеством.

Результат метода Шабадаша

Гликоген окрашивается в вишнево-фиолетовый цвет на зеленом фоне препарата.

Расчет количества гликогена производят по полуколичественному методуили выражают в процентах.