Методы изучения наследственности у человека. Цитогенетический метод (Материал подготовлен резидентом КазНМУ им. С.Д. Асфендиярова Енцовым Д. В.)

Методы изучения наследственности у человека. Цитогенетический метод

Материал подготовлен резидентом  КазНМУ им. С.Д. Асфендиярова Енцовым Д. В.

Принципы цитогенетических исследований сформировались в течение 20-30-х годов на классическом объекте генетики - дрозофиле и на некоторых растениях. Метод основан на микроскопическом исследовании хромосом.

Для идентификации хромосом применяют количественный морфометрический анализ. С этой целью проводят измерение длины хромосомы в микрометрах (микроскопия хромосом производится в остановленной фазе митоза посредством колхицина и отброшенными посредством гипотонического раствора, в результате чего хромосомы лежат свободно), определяют также соотношение длины короткого плеча к длине всей хромосомы (центромерный индекс).

В 1960 году была разработана первая классификация хромосом человека (Денверская), в основу ее были положены особенности величины хромосом и расположение первичной перетяжки. По форме и общим размерам все аутосомы человека подразделяются на 7 групп, обозначаемых латинскими буквами: A, B, C, D, E, F, G. Все хромосомы имеют порядковые номера. Наиболее крупная пара гомологичных хромосом имеет №1, следующая - №2 и т.д. Половые хромосомы - крупная X и мелкаяY - выделяются отдельно. В последнее время разрабатываются автоматические системы для измерения и количественного анализа хромосом. Однако идентификация хромосом только по указанным признакам встречает большие затруднения.

В 1968-1970 гг. были опубликованы работы шведского генетика Касперссона, который применил для изучения хромосом флуоресцентные красители, в частности акрихин-иприт и его производные. Последующее изучение в люминесцентном микроскопе показало, что хромосомы не дают равномерного свечения по длине. В ней выявляется несколько светящихся полос, совпадающих с локализацией структурного гетерохроматина. После удаления их хромосом ДНК они теряют почти полностью способность к флюоресценции.

Если после денатурации ДНК, вызванной нагреванием и некоторыми другими факторами, провести затем ее ренатурацию - восстановление исходной двунитчатой структуры, а затем окрасить хромосомы красителем Гимзы, то в них выявляется четкая дифференцировка на темноокрашенные и светлые полосы - диски. Последовательность расположения этих дисков, их рисунок - строго специфичен для каждой хромосомы. В результате различных вариантов метода удается выявить центромерный и околоцентромерный гетерохроматин (С-диски), диски, расположенные по длине хромосом (соответственно Гимзы-диски, G-диски).

Захаровым был разработан перспективный метод изучения хромосом. В основу его положен процесс неодновременной репликации хромосом: одни участки реплицируются раньше, у других этот процесс задерживается и репликация происходит значительно позднее. Неодновременно идет процесс спирализации хромосом, вступающих в митоз. Однако, к тому моменту, когда хромосомы вступают в метафазу, успевает завершиться процесс выравнивания этих различий, и степень конденсации метафазных хромосом становится одинаковой. Было показано, что можно задержать этот процесс путем введения 5-бромдезоксиуридина (5-БДУ), который является аналогом тимидина - предшественника ДНК. Если 5-БДУ вводить в конце S-периода. то он включается в синтез ДНК, то есть участки хромосом, где находится это вещество, остаются слабоокрашенными, так как была задержана спирализация. Рано редуплицировавшиеся участки хромосомы, успевшие спирализоваться, интенсивно окрашиваются (Р-диски). Расположение темных и светлых дисков при этом методе противоположно тому, что наблюдается при G-окраске.

Сравнительный анализ различных методов окраски показал, что один и тот же диск может выделяться как светлый неокрашенный или темноокрашенный, но порядок расположения дисков идентичен при всех методиках. Следовательно, не вызывает сомнения, что их расположение и последовательность имеют закономерный характер, специфичный для каждой хромосомы.

Если нарушения касаются половых хромосом, то методика упрощается. В этом случае проводится не полное кариотипирование, а применяется метод исследования полового хроматина в соматических клетках.

Половой хроматин - это небольшое дисковидное тельце, интенсивно окрашивающееся гематоксилином и другими основными красителями. Они обнаруживаются в интерфазных клеточных ядрах млекопитающих и человека, непосредственно под ядерной мембраной.

Определение полового хроматина нашло применение в судебной медицине, когда требуется по пятнам крови установить половую принадлежность, при анализе, когда надо установить, мужчине или женщине принадлежит найденная часть трупа, даже спустя довольно большой срок после смерти.

При трансплантации тканей тельце полового хроматина может служить своеобразной меткой (если донор и реципиент разных полов). Анализ дает возможность проследить приживление или рассасывание трансплантата.