Лентивирусная трансдукция малодифференцированных костно-мозговых клеток-предшественников in vivo (Н.В.Радюхина, П.Н.Руткевич, Т.И.Арефьева, А.В.Козлов, Т.Х.Гурская, А.Я.Шевелев, И.Н.Рыбалкин, Т.Н.Власик, О.П.Ильинская, Э.М.Тарарак)

Лентивирусная трансдукция малодифференцированных костно-мозговых клеток-предшественников in vivo

Н.В.Радюхина, П.Н.Руткевич, Т.И.Арефьева, А.В.Козлов,

Т.Х.Гурская, А.Я.Шевелев, И.Н.Рыбалкин, Т.Н.Власик, О.П.Ильинская, Э.М.Тарарак

В настоящее время перенос генов в кроветворные клетки-предшественники млекопитающих является перспективным и быстро развивающимся методом в биологии и медицине. Это стало возможным в связи с успехами в конструировании векторов, доставляющих гены, представляющие научный и лечебный интерес, в соответствующие клетки [1-3]. В качестве наиболее перспективных генетических конструкций для переноса генов в клетки-предшественники рассматриваются лентивирусные системы трансгенного переноса, в связи с их уникальной способностью доставлять гены в неделящиеся клетки, в том числе и в стволовые [4]. Однако пока максимально достигнутая эффективность трансдукции ранних костно-мозговых клеток-предшественников (КМКП) лентивирусными конструкциями незначительна и не превышает 20% [5, 6]. Низкая эффективность трансдукции (маркирования) таких клеток не позволяет получить полную картину их участия в развитии сосудистых патологий, реэндотелизации артериальной стенки или новообразований кровеносных сосудов.

Целью исследования являлась разработка оптимального способа переноса генов в геном малодифференцированных клеток костного мозга (КМ) с помощью лентивирусной трансдукции in vivo. Проводили сравнительный анализ двух генетических конструкций, полученных на основе лентивирусов кошачьего (FIV) и человеческого (HIV-1) иммунодефицитов, по их способности трансдуцировать КМКП мыши. В качестве репортерного использовали ген зеленого флюоресцентного белка (copGFP), позволяющий оценить эффективность трансдукции in vitro и, в дальнейшем, проследить за изменениями меченых клеток in vivo. Интеграцию выбранной генетической конструкции в КМКП in vivo контролировали по наличию в геномной ДНК потомков этих клеток векторной последовательности WPRE с помощью метода селезеночных колоний.

Материалы и методы

В работе использовали самок и самцов мышей-гибридов (CBAґC57Bl/6) F1 массой 18-20 г.

Получение препаратов псевдовирусных частиц. Для трансдукции КМКП апробировали два варианта генетических конструкций, созданных на основе FIV и HIV. В качестве репортерного обе конструкции содержали ген сорGFP под промотором человеческого цитомегаловируса (ЦМВ).

Для получения псевдовирусных частиц на основе HIV, кроме транспортной плазмиды pLA-CG-H1 («System Biosiences»), использовали две упаковочные плазмиды - pVSV-G и pHIVpack («System Biosciences»).

Для упаковки FIV-частиц использовали транспортную плазмиду pCopGXL-H1 («System Biosiences») и плазмиду pVSV-G-C34N, которая была объединена из двух плазмид - pVSV-G и pC34N («System Biosiences»).